13.9 X¸c ®Þnh ho¹t lùc thuèc kh¸ng sinh b»ng ph­¬ng ph¸p thö vi sinh vËt

 

Ho¹t lùc kh¸ng sinh ®­îc thÓ hiÖn b»ng kh¶ n¨ng øc chÕ mét lo¹i chñng chØ thÞ nµo ®ã, ë ®iÒu kiÖn thÝch hîp. Sù gi¶m ho¹t tÝnh sinh häc cña kh¸ng sinh ®­îc thÓ hiÖn trªn chñng chØ thÞ, rÊt khã ph¸t hiÖn b»ng ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch ho¸ häc, v× vËy ph­¬ng ph¸p vi sinh vËt th­êng gi÷ mét vai trß quan träng trong viÖc ®¸nh gi¸ kh¶ n¨ng mÊt ho¹t lùc cña kh¸ng sinh, nhÊt lµ nh÷ng lo¹i kh¸ng sinh cã cÊu tróc phøc t¹p, hoÆc thµnh phÇn gåm mét hçn hîp kh¸ng sinh cïng hä mµ møc ®é ho¹t lùc chªnh lÖch nhau kh«ng lín l¾m.

Ph­¬ng ph¸p vi sinh vËt x¸c ®Þnh ho¹t lùc cña mét kh¸ng sinh b»ng c¸ch so s¸nh t¸c ®éng øc chÕ sù ph¸t triÓn cña mét lo¹i vi sinh vËt (®­îc gäi lµ chñng chØ thÞ) bëi nh÷ng ®é pha lo·ng ®· biÕt cña kh¸ng sinh mang thö (ch­a biÕt râ ho¹t lùc) víi t¸c ®éng øc chÕ bëi nång ®é ®· biÕt cña kh¸ng sinh ®èi chiÕu (chÊt chuÈn ®· biÕt râ ho¹t lùc).

Thö nghiÖm ph¶i dïng ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch thèng kª ®Ó ®¸nh gi¸ nh÷ng sè liÖu thu ®­îc. NÕu ¸p dông m« h×nh ®­êng th¼ng song song, hai ®­êng log liÒu - ®¸p øng cña chÊt chuÈn vµ chÕ phÈm thö ph¶i song song víi nhau vµ ph¶i tuyÕn tÝnh trong kho¶ng liÒu ®· dïng.

Hai ph­¬ng ph¸p th­êng ®­îc sö dông trong kiÓm nghiÖm lµ ph­¬ng ph¸p khuÕch t¸n dïng m«i tr­êng th¹ch vµ ph­¬ng ph¸p  ®o ®é ®ôc dïng m«i tr­êng  láng.

Ph­¬ng ph¸p thø nhÊt dùa vµo sù khuÕch t¸n cña kh¸ng sinh tõ chç chøa qua líp th¹ch ®Æc ë hép Petri hoÆc khay vµo kho¶ng ph¸t triÓn cña vi sinh vËt t¹o ra mét vßng øc chÕ hoµn toµn xung quanh n¬i chøa (èng trô, lç th¹ch) dung dÞch kh¸ng sinh.

Ph­¬ng ph¸p èng nghiÖm dùa vµo ®é ®ôc cña canh khuÈn, biÕt ®­îc sù øc chÕ ph¸t triÓn cña vi khuÈn g©y ra bëi mét lo¹t dung dÞch kh¸ng sinh trong m«i tr­êng láng lµ m«i tr­êng thÝch hîp ®èi víi sù ph¸t triÓn cña vi sinh vËt khi kh«ng cã kh¸ng sinh.

Ph­¬ng tiÖn vµ dông cô

TÊt c¶ c¸c dông cô ph¶i ®­îc lµm s¹ch hoµn toµn tr­íc vµ sau mçi lÇn thÝ nghiÖm. Nh÷ng dông cô thuû tinh vµ nh÷ng ®å ®ùng kh¸c dïng trong thÝ nghiÖm ph¶i ®­îc lo¹i hÕt vi khuÈn vµ chÊt ¶nh h­ëng. C¸c dông cô dïng ®Ó gi÷ vµ chuyÓn chñng chØ thÞ cÇn lµm s¹ch cÈn thËn vµ tiÖt khuÈn b»ng søc nãng kh« hoÆc h¬i n­íc ë ®iÒu kiÖn thÝch hîp.

§iÒu kiÖn nhiÖt ®é: Khi nu«i cÊy chñng chØ thÞ vµ chÕ t¹o nhò dÞch cÊy truyÒn, cÇn thùc hiÖn trong m«i tr­êng ®¶m b¶o nhiÖt ®é qui ®Þnh. §èi víi ph­¬ng ph¸p ®o ®é ®ôc, cÇn kiÓm tra chÆt chÏ buång ®iÒu khiÓn nhiÖt ®é sao cho nhiÖt ®é quanh c¸c èng nghiÖm ph¶i ®ång ®Òu vµ ph¶i ®¹t ®­îc nhiÖt ®é cÇn thiÕt trong èng nghiÖm. Nªn dïng ®iÒu nhiÖt b»ng n­íc lu©n chuyÓn sÏ tèt h¬n ®iÒu nhiÖt b»ng kh«ng khÝ.

M¸y ®o quang phæ: §­îc dïng ®Ó ®o sù truyÒn qua hoÆc hÊp thô trong kho¶ng sãng kh¸ hÑp, do ®ã cÇn  cã m¸y ®o quang thÝch hîp cã thÓ thay ®æi ®­îc b­íc sãng hoÆc dïng dïng kÝnh läc 650 nm hoÆc 580 nm ®Ó ®o nhò dÞch nu«i cÊy ®· pha chÕ vµ dïng kÝnh läc 530 nm ®Ó ®o ®é hÊp thô ¸nh s¸ng ë ph­¬ng ph¸p ®o ®é ®ôc. Dïng canh thang ®· tiÕn hµnh nh­ mÉu nh­ng thªm ngay dung dÞch formaldehyd ®Ó chØnh m¸y cho ®é hÊp thô vÒ ®iÓm “ 0 ”

Dông cô thÝ nghiÖm:

- Ph­¬ng ph¸p khuÕch t¸n: Dïng c¸c  khay hoÆc ®Üa Petri b»ng thuû tinh hoÆc plastic, ®¹t tiªu chuÈn b»ng ph¼ng. §Üa Petri cã hai lo¹i, cì nhá ®­êng kÝnh 100 mm, cì lín ®­êng kÝnh lín h¬n 160 mm. C¸c khay thÝ nghiÖm ®· ®­îc tiªu chuÈn ho¸, b»ng kÝnh hoÆc plastic víi kÝch th­íc 25 x 25 cm (lo¹i vu«ng) hoÆc 28,8 x 19,8 cm (lo¹i ch÷ nhËt). Cã thÓ sö dông nh÷ng chÊt liÖu thÝch hîp ®¹t tiªu chuÈn b»ng ph¼ng.

èng trô b»ng thÐp kh«ng rØ, b»ng thuû tinh, hoÆc b»ng sø, cã kÝch th­íc nh­ sau: §­êng kÝnh ngoµi 8,0 mm; ®­êng kÝnh trong 6,0 mm; cao 10,0 mm.

VËt liÖu dïng lµm èng trô ph¶i lµ lo¹i tr¬, riªng ®èi víi kh¸ng sinh nh¹y c¶m víi ¸nh s¸ng ph¶i dïng vËt liÖu cã pha mµu n©u. Khi dïng ph¶i lµm s¹ch cÈn thËn, lo¹i hÕt cÆn, khö khuÈn. §«i khi ph¶i röa b»ng acid nh­ dung dÞch acid nitric 2M, hoÆc acid sulfocromic.

Dông cô dïng cho ph­¬ng ph¸p ®o ®é ®ôc: Dïng c¸c èng nghiÖm lo¹i 16 x 125 mm hoÆc 18 x 150 mm b»ng thuû tinh cã cïng chiÒu dµi, ®­êng kÝnh vµ ®é dµy, bÒ  mÆt ph¶i kh«ng cã vÕt x­íc, kh«ng d©y bÈn. Khi dïng, èng nghiÖm ph¶i s¹ch hoµn toµn, ®¶m b¶o kh«ng cßn vÕt kh¸ng sinh hoÆc vÕt c¸c chÊt tÈy röa vµ ph¶i tiÖt khuÈn tr­íc khi dïng.

M«i tr­êng, dung m«i vµ chÊt pha lo·ng

  Ph¶i dïng c¸c chÊt ®¹t tõ møc tinh khiÕt ho¸ häc trë lªn ®Ó pha chÕ.

M«i tr­êng

D­íi ®©y lµ c«ng thøc m«i tr­êng cÇn thiÕt dïng cho kiÓm nghiÖm kh¸ng sinh. C¸c lo¹i m«i tr­êng nµy cã thÓ ®­îc thay thÕ b»ng m«i tr­êng kh« t­¬ng øng hoÆc b»ng mét lo¹i m«i tr­êng thóc ®Èy vi sinh vËt ph¸t triÓn tèt h¬n mµ cïng cho mét ®­êng ®¸p øng t­¬ng tù. Pha m«i tr­êng b»ng c¸ch hoµ tan thµnh phÇn trong c«ng thøc vµo mét phÇn n­íc, sau ®ã thªm n­íc võa ®ñ mét lÝt. Dïng dung dÞch acid hydrocloric 1N  hoÆc dung dÞch natri hydroxyd 1N ®Ó ®iÒu chØnh m«i tr­êng sao cho sau khi tiÖt khuÈn ë 121^oC trong
15 phót cã pH nh­ ghi trong c«ng thøc. Thêi gian cÇn cho viÖc tiÖt khuÈn cã thÓ kÐo dµi tíi 30 phót ®èi víi nh÷ng m«i tr­êng cã thÓ tÝch lín h¬n 500 ml.

M«i tr­êng sè 1

Pepton kh«                               Casein pancreatic                     Cao men bia                             Dextrose monohydrat             Th¹ch                                       N­íc cÊt                               pH: 6,0 ®Õn 7,0

6,0 g 4,0 g 3,0 g 1,0 g 20,0 g 1000 ml

  M«i tr­êng sè 2:

Pepton kh«                               Cao men bia                              Cao thÞt                                     Th¹ch                                     N­íc cÊt                               pH: 6,0 ®Õn 7,0

6,0 g 3,0 g 1,5 g 20,0 g 1000 ml

M«i tr­êng sè 3:

Pepton kh«                                      Cao men bia                                    Cao thÞt Dextrose monohydrat Dikali hydrophosphat (K2HPO4) Kali dihydrophosphat (KH2PO4)      Natri clorid                                      N­íc cÊt pH: 6,0 ®Õn 7,0

5,0 g 1,5 g 1,5 g 1,0 g 3,58 g 1.32 g 3,5 g 1000 ml

M«i tr­êng sè 4:

Gièng nh­ m«i tr­êng sè 2 nh­ng cã pH lµ 7,0 ®Õn 8,0.

M«i tr­êng sè 5:

Gièng nh­ m«i tr­êng sè 1, nh­ng cã pH lµ 7,8 ®Õn 8,0.

M«i tr­êng sè 6:

Casein pancreatic                          Bét ®Ëu t­¬ng papaic                     Natri clorid                                     Dextrose monohydrat                     Dikali hydrophosphat (K2HPO4) Th¹ch                                            Polysorbat 80                                 N­íc cÊt                                      pH : 7,0 ®Õn 7,3

17,0 g 3,0 g 5,0 g 2,5 g 2,5 g 15,0 g 10,0 ml 1000 ml

Chó ý: Polysorbat 80 ®­îc thªm vµo mét l­îng dung dÞch nãng cña c¸c thµnh phÇn kh¸c tr­íc khi thªm n­íc võa ®ñ dung tÝch cÇn thiÕt.

M«i tr­êng sè 7:

Pepton kh«                                Cao men bia                             Cao thÞt                                     Dextrose monohydrat              Natri clorid Th¹ch                                       N­íc cÊt                               pH: 6,0 ± 0,2

9,4  g 4,7  g 2,4  g 10,0 g 10,0 g 20,0 g 1000 ml

Dung m«i vµ chÊt pha lo·ng

Dung m«i vµ chÊt pha lo·ng dïng trong thÝ nghiÖm ph¶i kh«ng ¶nh h­ëng ®Õn sù ph¸t triÓn cña vi sinh vËt. Chóng ®­îc dïng ®Ó pha c¸c dung dÞch theo yªu cÇu trong tõng thÝ nghiÖm. C¸c lo¹i dung m«i nh­ n­íc v« khuÈn, acid hydrocloric, ethanol, dimethylformamid vµ c¸c dung dÞch ®Öm cã d¶i pH kh¸c nhau hoÆc c¸c lo¹i kh¸c tuú thuéc vµo tõng kh¸ng sinh riªng biÖt (b¶ng 2).

C¸c dung dÞch ®Öm phosphat ®­îc chÕ t¹o b»ng c¸ch hoµ tan l­îng dikali hydrophosphat vµ kali dihydrophosphat  (theo b¶ng 1) vµo trong n­íc võa ®ñ ®Ó ®­îc 1000 ml. Sau ®ã ®iÒu chØnh víi acid phosphoric 18 N hoÆc natri hydroxyd 18 N ®Õn pH cÇn thiÕt. Gi¸ trÞ pH chØ ra trong b¶ng lµ pH cña dung dÞch sau khi ®· tiÖt khuÈn.

B¶ng 1.

Sè dung dÞch ®Öm	Dikali hydrophosphat  K2HPO4 (g)	Kali dihydrophosphat  KH2PO4 (g)	pH ®iÒu chØnh ®Õn
1 2 3 4 5 6	2,0 16,73 0 20,0 35,0 13,6	8,0 0,523 13,61 80,0 0 4,0	6,0 ± 0,1 8,0 ± 0,1 4,5 ± 0,1 6,0 ± 0,1 10,5 ± 0,1 7,0 ± 0,2

ChÊt ®èi chiÕu vµ ®¬n vÞ

ChÊt ®èi chiÕu ®­îc dïng trong thö nghiÖm lµ nh÷ng chÊt cã ho¹t lùc ®­îc x¸c ®Þnh chÝnh x¸c so víi chuÈn quèc tÕ hoÆc chÊt ®èi chiÕu quèc tÕ t­¬ng øng.

Ho¹t lùc cña mét kh¸ng sinh ®­îc thÓ hiÖn b»ng ®¬n vÞ quèc tÕ. Mét ®¬n vÞ quèc tÕ lµ ho¹t lùc ®Æc biÖt chøa trong mét l­îng (tÝnh theo c©n nÆng) cña chuÈn sinh häc quèc tÕ t­¬ng øng hoÆc chÕ phÈm ®èi chiÕu sinh häc quèc tÕ.  Tõng thêi kú, Héi ®ång vÒ chuÈn sinh häc cña Tæ chøc y tÕ thÕ giíi sÏ cã chØ dÉn vµ qui ®Þnh chÝnh x¸c cho mçi chuÈn quèc tÕ . Trong mét vµi tr­êng hîp, ®Þnh nghÜa sè ®¬n vÞ quèc tÕ cã thÓ bao gåm mét tæng l­îng cña mét vµi nguyªn liÖu v× thùc tÕ khã c©n mét l­îng nhá dï chÝnh x¸c cña chÊt chuÈn sinh häc quèc tÕ hoÆc chÊt ®èi chiÕu sinh häc quèc tÕ.

Ho¹t lùc cña mét vµi chÊt kh¸ng sinh cã thÓ ®­îc biÓu thÞ b»ng mg. mg ho¹t lùc kh«ng nhÊt thiÕt t­¬ng øng víi khèi l­îng cña chÊt kh¸ng sinh v× nã kh«ng thÓ bao hµm toµn bé thùc thÓ ho¸ häc tinh khiÕt riªng cña tõng kh¸ng sinh ®ã.

Chñng chØ thÞ vµ dÞch cÊy truyÒn

C¸c chñng chØ thÞ dïng ph¶i nh¹y c¶m, phï hîp víi tõng kh¸ng sinh, theo qui ®Þnh ë b¶ng 2. Cã thÓ dïng chñng chØ thÞ kh¸c víi chñng chØ thÞ giíi thiÖu trong chuyªn luËn nµy miÔn sao chñng ph¶i nh¹y c¶m víi kh¸ng sinh cÇn ®Þnh l­îng.             

ChÕ t¹o dÞch cÊy truyÒn

ChÕ t¹o nhò dÞch vi khuÈn kh«ng cã nha bµo

Escherichia coli

Klebsiella pneumoniae (kh«ng t¹o vá )

Micrococcus luteus

Saccharomyces cerevisiae

Staphylococcus aureus

Staphylococcus epidermidis

Streptococcus faecium

Dïng chñng chØ thÞ míi ph¸t triÓn trªn th¹ch nghiªng sau 24 giê, cÊy truyÒn l¹i lªn mÆt mét èng th¹ch nghiªng kh¸c hoÆc mét bÒ mÆt th¹ch réng (nh­ trong b×nh Roux) cña m«i tr­êng sè 1 (Saccharomyces cerevicae dïng m«i tr­êng sè 8; Streptococcus faecium dïng m«i tr­êng sè 3) ñ ë 32 - 35⁰C trong 24 giê (riªng víi Klebsiella pneumoniae vµ Streptococcus faecium ñ ë 37⁰C) víi Saccharomyces cerevisiae ñ ë 30⁰C. Thu vi khuÈn ®· ph¸t triÓn trªn bÒ mÆt m«i tr­êng b»ng n­íc muèi sinh lý, råi hoµ lo·ng víi cïng mét chÊt hoµ lo·ng tíi ®é ®ôc thÝch hîp ®Ó ®­îc ®¸p øng thÝch hîp trong ph­¬ng ph¸p ®o ®é ®ôc, hoÆc ®Ó t¹o ra vïng øc chÕ râ rµng, s¾c nÐt thuËn lîi khi ®o trong ph­¬ng ph¸p khuÕch t¸n.

ThÝ dô: Pha lo·ng hçn dÞch vi khuÈn tíi nång ®é sao cho khi ®o ë b­íc sãng 650 nm, cèc ®o dµy 1cm, ®é truyÒn qua T = 50%, ë b­íc sãng 580 nm T = 25%, hay cho vßng vo khuÈn râ, s¾c net cã ®­êng kÝnh 13 mm.

Nhò dÞch vi khuÈn chÕ t¹o nh­ trªn ®em b¶o qu¶n ë nhiÖt ®é d­íi 4⁰C cã thÓ sö dông trong 2 tuÇn.

ChÕ t¹o nhò dÞch nha bµo

Bacillus cereus

Bacillus pumilus

Bacillus subtilis

Cho chñng vi khuÈn mäc qua ®ªm trªn èng th¹ch nghiªng m«i tr­êng sè 1 ë 37⁰C (riªng víi Bacillus cereus nu«i ë 30⁰C). Thu vi khuÈn ®· ph¸t triÓn trªn mÆt th¹ch b»ng n­íc muèi sinh lý, råi chuyÓn sang mét bÒ mÆt th¹ch réng h¬n (nh­ trong b×nh Roux) cña m«i tr­êng sè 1, trong m«i tr­êng nµy ®· thªm vµo dung dÞch 0,001% (kl/tt) mangan sulfat (MnSO₄) ®Ó gióp thóc ®Èy sù h×nh thµnh nha bµo. Nhò dÞch vi sinh vËt  ®­îc tr¶i cho phñ kÝn bÒ mÆt m«i tr­êng b»ng c¸ch cho vµo bÒ mÆt th¹ch mét vµi viªn bi  thuû tinh v« khuÈn. §em ñ ë 37⁰C (riªng víi Bacillus cereus ñ ë 30⁰C) trong 7 ngµy. Dïng n­íc cÊt v« khuÈn röa vi khuÈn ®· mäc (chñ yÕu lµ nha bµo) ®em hoµ lo·ng tíi nång ®é thÝch hîp, thÝ dô kho¶ng 10⁷ - 10⁸ nha bµo trong 1ml, ®un c¸ch thñy nhò dÞch nha bµo ë nhiÖt ®é 70^oC trong 30 phót. Dïng test phiÕn kÝnh ®Ó kiÓm tra kh¶ n¨ng sèng cña nha bµo. X¸c ®Þnh l­îng nhò dÞch nha bµo ®Ó cho vµo 100 ml m«i tr­êng ®Þnh l­îng  cã thÓ t¹o ®­îc vïng øc chÕ râ rµng, s¾c nÐt. Nhò dÞch nha bµo cã thÓ gi÷ l©u ë nhiÖt ®é 4⁰C.

C¸c lo¹i  thö  nghiÖm

Thö nghiÖm hai liÒu vµ ba liÒu.

Ph­¬ng ph¸p khuÕch t¸n

Pha dung dÞch chuÈn vµ dung dÞch thö: Dung dÞch chuÈn nång ®é ®· biÕt vµ dung dÞch thö ®­îc coi nh­ xÊp xØ nång ®é dung dÞch chuÈn. C¸c dung dÞch chuÈn vµ thö nµy ban ®Çu ®­îc pha vµo dung m«i thÝch hîp ®Ó ®­îc nh÷ng dung dÞch gèc. Sau ®ã pha lo·ng dung dÞch gèc b»ng dung m«i hoÆc dung dÞch ®Öm v« khuÈn ®Õn nång ®é thÝch hîp, cã pH thÝch hîp cho tõng lo¹i kh¸ng sinh ( xem b¶ng 2). §Ó x¸c ®Þnh hiÖu lùc cña kh¸ng sinh, dïng ba liÒu kh¸c nhau cña chuÈn (S₁, S₂, S₃) mang so s¸nh víi ba liÒu kh¸c nhau cña thö (U₁, U₂, U₃) cã ho¹t lùc ®­îc coi nh­ dung dÞch chuÈn. Nång ®é ®­îc pha theo cÊp sè nh©n, thÝ dô pha mét lo¹t ®é pha lo·ng theo tû lÖ 2 : 1 hoÆc 4 : 1.  NÕu quan hÖ gi÷a logarit nång ®é kh¸ng sinh vµ ®­êng kÝnh vïng øc chÕ ®· chØ ra gÇn nh­ th¼ng víi hÖ sè ®· dïng th× cã thÓ dïng ®Þnh l­îng th­êng xuyªn b»ng c¸ch chØ dïng hai nång ®é chuÈn (S₁, S₂) vµ hai nång ®é thö (U₁, U₂) - Thö nghiÖm hai liÒu. Trong tr­êng hîp cã tranh chÊp b¾t buéc ph¶i sö dông ®Þnh l­îng ba liÒu.

ChuÈn bÞ  cÊy truyÒn

 C¸c thö nghiÖm cã thÓ tiÕn hµnh trªn nh÷ng ®Üa Petri hoÆc khay b»ng ph¼ng. §æ vµo hép Petri hoÆc khay m«i tr­êng thÝch hîp ®· cÊy truyÒn chñng chØ thÞ thÝch hîp cho tõng kh¸ng sinh. Líp m«i tr­êng nµy th­êng cã ®é dµy 3 - 4 mm (riªng víi amphotericin B nystatin ®é dµy lµ 1 - 2 mm, ®èi víi bleomycin, mithramycin ®é dµy 2 - 3 mm). Th¹ch dinh d­ìng cã thÓ ®­îc ®æ thµnh mét líp hoÆc hai líp (gåm líp nÒn kh«ng cã vi khuÈn vµ líp gieo cÊy), nªn chän nång ®é nhò dÞch cÊy vµo m«i tr­êng sao cho t¹o ®­îc vïng øc chÕ s¾c nÐt nhÊt t­¬ng øng víi c¸c liÒu l­îng cña kh¸ng sinh. Dïng nhò dÞch chñng chØ thÞ ®· chÕ t¹o nh­ phÇn trªn, th­êng cÊy vµo m«i tr­êng víi nång ®é 1 ml chñng cho 100 ml m«i tr­êng lµ thÝch hîp. Khi nhò dÞch chñng lµ lo¹i kh«ng cã nha bµo, th­êng ph¶i cÊy vµo m«i tr­êng th¹ch ®· ®un ch¶y hoµn toµn vµ ®Ó nguéi ®Õn 45 - 50⁰C. Tr­êng hîp nhò dÞch chñng lµ nha bµo, nhiÖt ®é cho phÐp khi cÊy tèi ®a lµ 65 - 70⁰C. Dïng mét l­îng thÝch hîp m«i tr­êng ®· cÊy chñng chØ thÞ, rãt mét c¸ch v« khuÈn vµo ®Üa petri hoÆc khay kÝnh (trªn ®Üa th¹ch hoÆc khay ®· cã th¹ch nÒn hoÆc kh«ng tuú theo yªu cÇu) ®Ó ®­îc mét líp m«i tr­êng cã ®é dµy thÝch hîp, dµn tr¶i nhanh vµ ®Ëy n¾p ngay. Trong khi ®îi th¹ch ®«ng ®Æc, ®Æt khay kÝnh hoÆc hép petri trªn mét tÊm kÝnh ®Ó t¹o mét mÆt ph¼ng gióp cho m«i tr­êng trªn khay hoÆc hép cã ®é dµy ®ång nhÊt. Nh÷ng m«i tr­êng ®· chuÈn bÞ ®­îc ®Ó kh« ë nhiÖt ®é phßng 30 phót tr­íc khi sö dông (riªng ®èi víi colistin vµ colistin sulfomethat natri, ®Üa petri hoÆc khay kÝnh ®· cÊy truyÒn ph¶i ®Ó ë tñ l¹nh 4⁰C trong vµi giê).

TiÕn hµnh thö:

§èi víi thö nghiÖm 3 liÒu, dïng 6 èng trô v« khuÈn ®Æt lªn mÆt th¹ch ®· cÊy truyÒn trong mét hép petri (víi thö nghiÖm 2 liÒu dïng 4 èng trô cho mçi hép). Cã thÓ thay c¸c èng trô   b»ng c¸ch dïng dông cô ®ôc lç ®· tiÖt khuÈn, ®ôc vµo m«i tr­êng th¹ch ®Ó t¹o ra nh÷ng lç th¹ch ®­êng kÝnh 6 - 8 mm (hoÆc thay b»ng nh÷ng khoanh giÊy tÈm kh¸ng sinh). Ph©n phèi c¸c dung dÞch thö nghiÖm cña chuÈn vµ mÉu thö trªn mçi hép Petri hay khay vu«ng sao cho phï hîp víi kiÓu bè trÝ thÝ nghiÖm ®· chän (xem phô lôc 13.10). ViÖc bè trÝ èng trô, lç khoan, hoÆc khoanh giÊy trªn mÆt th¹ch ph¶i sao cho c¸c vïng øc chÕ kh«ng bÞ trïm lªn nhau.

Dïng pipet nhá vµo èng trô, hoÆc lç th¹ch mét l­îng b»ng nhau c¸c dung dÞch kh¸ng sinh. NÕu dïng c¸c khoanh giÊy ph¶i tiªu chuÈn ho¸ tr­íc thÓ tÝch chÝnh x¸c chÊt láng cho mçi khoanh giÊy. Gi÷ hép petri hoÆc khay ë nhiÖt ®é phßng trong kho¶ng 1 - 4 giê tuú theo ®Æc tÝnh cña mçi kh¸ng sinh. §èi víi nh÷ng kh¸ng sinh nh¹y c¶m víi nhiÖt ®é, ph¶i ®­îc gi÷ ë nhiÖt ®é 4⁰C ®Ó sù khuÕch t¸n cña kh¸ng sinh vµo m«i tr­êng xÈy ra chËm vµ lµm gi¶m ®Õn møc tèi thiÓu hiÖu qu¶ cña sù biÕn ®æi theo thêi gian gi÷a c¸c dung dÞch kh¸c nhau. §èi víi colistin vµ colistin sulfomethat natri nªn ®Ó 2 - 4 giê ë nhiÖt ®é phßng tr­íc khi ñ. C¸c hép Petri hoÆc khay sau thêi gian ®Ó khuÕch t¸n, mang ñ ë nhiÖt ®é thÝch hîp cho tõng kh¸ng sinh riªng (b¶ng 2). NhiÖt ®é ñ ph¶i ®­îc kiÓm tra ®Ó kho¶ng nhiÖt ®é chªnh lÖch so víi quy ®Þnh chØ trong kho¶ng ± 0,5⁰C. Thêi gian ñ th­êng kÐo dµi 16 - 18 giê. Dïng dông cô ®o cã ®é chÝnh x¸c tèi thiÓu 0,1mm, ®o ®­êng kÝnh vïng øc chÕ t¹o bëi c¸c nång ®é kh¸c nhau cña chuÈn vµ thö.

KiÓm tra tÝnh cã gi¸ trÞ cña ®Þnh l­îng, tÝnh ho¹t lùc vµ giíi h¹n tin cËy cña ho¹t lùc kh¸ng sinh theo phô lôc 13.10  

 

Ph­¬ng ph¸p ®o ®é ®ôc

Pha c¸c dung dÞch thö nghiÖm cña chuÈn vµ  mÉu thö

Dung dÞch dÞch thö nghiÖm cña chuÈn vµ  mÉu thö ®­îc pha trong dung m«i  thÝch hîp vµ ®­îc pha lo·ng b»ng dung dÞch ®Öm phosphat cã pH thÝch hîp cho tõng kh¸ng sinh theo chØ dÉn ë b¶ng 2. §Ó ®¶m b¶o gi¸ trÞ hiÖu lùc cña phÐp thö, lµm thö nghiÖm 3 liÒu lµ thÝch hîp. Pha song song nh÷ng ®é hoµ lo·ng gåm 3 liÒu chuÈn (S₁, S₂, S₃) vµ 3 liÒu thö (U₁, U₂, U₃).

ChÕ t¹o canh thang ®Ó cÊy truyÒn

§Ó cã ®­îc mét ®é ®ôc thÝch hîp dïng ®­îc ngay ë dÞch cÊy truyÒn, pha dÞch cÊy truyÒn nh­ m« t¶ ë phÇn chÕ t¹o nhò dÞch cÊy truyÒn råi dïng ngay. Chñng chØ thÞ  vµ ®iÒu kiÖn thö nghiÖm cña tõng kh¸ng sinh sö dông trong ph­¬ng ph¸p nµy ®­îc ghi trong b¶ng 2.

TiÕn hµnh

C¸c èng nghiÖm ®­îc xÕp thµnh tõng nhãm, mçi nhãm 3 - 5 èng, thªm vµo mçi èng 1 ml dung dÞch cña tõng ®é pha lo·ng cña dung dÞch chuÈn hoÆc mÉu thö. §Æt c¸c èng nghiÖm vµo gi¸ èng nghiÖm theo quy t¾c ngÉu nhiªn theo khèi hoÆc theo h×nh vu«ng latinh. Trong mçi gi¸ cã 2 èng dïng kiÓm tra kh«ng thªm kh¸ng sinh, mét èng chøa 1 ml dÞch pha lo·ng, cßn èng kia chøa 1 ml dÞch pha lo·ng vµ 0,5 ml dung dÞch formaldehyd 12% (tt/tt).

Thªm vµo mçi èng 9 ml canh thang ®· cÊy truyÒn. §Æt gi¸ ®· chuÈn bÞ xong ngay vµo trong tñ Êm hoÆc c¸ch thuû, gi÷ ë nhiÖt ®é thÝch hîp, khèng chÕ nhiÖt ®é ë møc sai sè ± 0,5⁰C so víi nhiÖt ®é cÇn ñ (theo b¶ng 2) trong 3 - 4 giê. Sau khi ñ, lµm ngõng sù ph¸t triÓn cña vi khuÈn b»ng c¸ch thªm vµo mçi èng 0,5 ml dung dÞch formaldehyd 12% (tt/tt) trõ èng kiÓm tra ®· thªm formaldehyd 12% tr­íc hoÆc nhóng gi¸ cã c¸c èng nghiÖm ®· ñ vµo n­íc s«i . LÊy tõng gi¸ èng nghiÖm khái n¬i ñ, x¸c ®Þnh ®é truyÒn qua hoÆc ®é hÊp thô cña mçi dung dÞch b»ng m¸y ®o quang ë 530 nm.

KiÓm tra tÝnh cã gi¸ trÞ cña ®Þnh l­îng, tÝnh ho¹t lùc vµ giíi h¹n tin cËy cña ho¹t lùc kh¸ng sinh theo phô lôc 13.10 

Ph­¬ng ph¸p ®­êng chuÈn

Hoµ tan mét l­îng c©n chÝnh x¸c chÊt ®èi chiÕu hoÆc chÊt chuÈn sinh häc cña mét kh¸ng sinh ®· cho trong dung m«i thÝch hîp, cã thÓ ph¶i lµm kh« tr­íc. Pha lo·ng víi dung m«i qui ®Þnh ®Ó ®­îc d·y chuÈn cã 5 nång ®é. Tû lÖ t¨ng gi÷a c¸c n«ng ®é nªn lµ 1: 1,25. (xem h­íng dÉn ë b¶ng 2)

TiÕn hµnh

Khi tiÕn hµnh x©y dùng ®­êng chuÈn, kh¶o s¸t trªn Ýt nhÊt 12 hép Petri. Khi x¸c ®Þnh hµm l­îng cña mét kh¸ng sinh dïng Ýt nhÊt 3 hép Petri. §æ vµo mçi hép Petri 21 ml m«i tr­êng ®· ®un ch¶y, ®îi th¹ch ®«ng cøng l¹i t¹o thµnh líp cã ®é dµy ®ång ®Òu vµ mét bÒ mÆt b»ng ph¼ng ®Ó lµm nÒn. (Riªng víi amphotericin B, nystatin th× kh«ng dïng líp nÒn). §èi víi bleomycin, cycloserin, mithramycin hoÆc mytomycin dïng 10 ml lµm líp nÒn. Líp nu«i cÊy dïng 4 ml cho mçi hép, ®­îc ®æ vµ l¸ng ®Òu sau khi líp nÒn ®· ®«ng cøng, ®Æt lªn mÆt th¹ch trong ®Üa 6 èng trô b»ng thÐp kh«ng rØ hoÆc nh÷ng èng b»ng chÊt liÖu kh¸c nh­ ®· quy ®Þnh ë phÇn dông cô. C¸c èng trô t¹o thµnh mét h×nh lôc gi¸c ®Òu c¸ch t©m kho¶ng 2,8 cm.  Chia 12 hép Petri ®Ó x©y dùng ®­êng chuÈn thµnh 4 nhãm, mçi nhãm 3 hép. Dung dÞch cã nång ®é trung gian ®­îc lÊy lµm nång ®é kiÓm tra dïng hiÖu chØnh c¸c gi¸ trÞ ®o ®­îc ë mçi nhãm. §æ ®Çy dung dÞch kiÓm tra vµo 3 èng trô, bè trÝ xen kÏ trong mçi hép Petri. C¸c èng trô cßn l¹i ®­îc ®æ ®Çy dung dÞch cã nång ®é cña mét nhãm. Sau khi ñ c¸c hép ë nhiÖt ®é thÝch hîp 32 - 35⁰C (theo chØ dÉn b¶ng 2) kho¶ng 16 - 18 giê sÏ ®o ®­îc 9 gi¸ trÞ ®­êng kÝnh vßng v« khuÈn cña nång ®é kiÓm tra theo nhãm. Tæng sè c¶ 4 nhãm sÏ ®o ®­îc 36 gi¸ trÞ ®­êng kÝnh vßng v« khuÈn ë nång ®é kiÓm tra. §é chÝnh x¸c cña mçi kÕt qu¶ ®o lµ ± 0,1 mm.

C¸ch tÝnh

Gi¸ trÞ trung b×nh c¸c ®­êng kÝnh vßng v« khuÈn ë mçi nång ®é lµ a, b, d, e; gi¸ trÞ trung b×nh c¸c ®­êng kÝnh vßng v« khuÈn ë nång ®é kiÓm tra cña mçi nhãm 3 hép (9 kÕt qu¶) lµ C_a, C_b, C_d, C_e vµ gi¸ trÞ trung b×nh c¸c ®­êng kÝnh vßng v« khuÈn cña nång ®é kiÓm tra ë tÊt c¶ 12 hép (ký hiÖu lµ C), gåm 36 kÕt qu¶ .

So s¸nh gi¸ trÞ trung b×nh cña c¸c ®­êng kÝnh vßng v« khuÈn ë nång ®é kiÓm tra cña mçi nhãm víi gi¸ trÞ trung b×nh cña c¸c ®­êng kÝnh vßng v« khuÈn ë nång ®é kiÓm tra cña 12 hép(C). HiÖu cña chóng (C - C_a; v. v... ) lµ sè hiÖu chØnh dïng ®Ó ®iÒu chØnh gi¸ trÞ trung b×nh cña c¸c ®­êng kÝnh vßng v« khuÈn ë nång ®é mçi nhãm. Céng ®¹i sè gi¸ trÞ hiÖu chØnh ®¹t ®­îc vµo gi¸ trÞ trung b×nh cña ®­êng kÝnh vßng v« khuÈn ë nång ®é cña mçi nhãm ta ®­îc c¸c gi¸ trÞ trung b×nh cña c¸c ®­êng kÝnh vßng v« khuÈn ®· hiÖu chØnh cña mçi nång ®é lµ  a, b, d, e.

ThÝ dô: Gi¸ trÞ trung b×nh cña ®­êng kÝnh 36 vßng v« khuÈn ë nång ®é kiÓm tra tÝnh ®­îc lµ 19,2 mm; gi¸ trÞ trung b×nh cña ®­êng kÝnh vßng v« khuÈn ë nång ®é kiÓm tra cña nhãm nång ®é a lµ C_a = 19,0 mm. Sè hiÖu chØnh lµ 19,2 - 19,0 = 0,2 mm. Gi¸ trÞ trung b×nh cña ®­êng kÝnh vßng v« khuÈn ë nång ®é cña nhãm lµ 17,9 mm. VËy gi¸ trÞ trung b×nh cña ®­êng kÝnh vßng v« khuÈn ë nång ®é cña nhãm sau khi ®· hiÖu chØnh lµ   a = 17,9 + 0,2 = 18,1 mm.

Trªn hai chu kú giÊy b¸n logarit vÏ ®­êng chuÈn qua c¸c ®iÓm gi¸ trÞ trung b×nh ®· hiÖu chØnh. Trªn trôc tung (chia theo thang logarit) lÊy nång ®é kh¸ng sinh b»ng µg hoÆc ®¬n vÞ ho¹t lùc trong ml. Trªn trôc hoµnh (chia theo thang sè häc) lÊy gi¸ trÞ ®­êng kÝnh vßng øc chÕ. Nh­ vËy ®­êng chuÈn ®­îc vÏ qua ®iÓm t­¬ng øng víi gi¸ trÞ ®­êng kÝnh vßng øc chÕ cao nhÊt vµ thÊp nhÊt tÝnh ®­îc b»ng ph­¬ng tr×nh sau:

 

L  =	3a + 2b + C - e
	5
H  =	3e + 2d + C - a
	5

                                                             

L: §­êng kÝnh vßng v« khuÈn tÝnh cho nång ®é thÊp nhÊt cña ®­êng chuÈn.

H: §­êng kÝnh vßng v« khuÈn tÝnh cho nång ®é cao nhÊt cña ®­êng chuÈn.

C: §­êng kÝnh trung b×nh cña 36 kÕt qu¶ cña nång ®é kiÓm tra.

a, b, d, vµ e: Nh÷ng gi¸ trÞ ®­êng kÝnh trung b×nh ®· hiÖu chØnh cho tõng dung dÞch cßn l¹i xÕp theo thø tù tõ nång ®é thÊp nhÊt tíi nång ®é cao nhÊt.

Ba hép Petri dïng cho mÉu thö nghiÖm còng ®­îc tiÕn hµnh ®ång thêi khi x©y dùng ®­êng chuÈn. Trong ba hép nµy nhá xen kÏ gi÷a nång ®é trung gian cña dung dÞch chuÈn víi nång ®é cña  mÉu thö ®· pha lo·ng víi dung dÞch ®Öm thÝch hîp ®Ó cã nång ®é gi¶ ®Þnh t­¬ng ®­¬ng nång ®é trung gian cña chuÈn.

Sau khi ®o ®­êng kÝnh c¸c vßng v« khuÈn cña mÉu thö, tÝnh trung b×nh hiÖu chØnh theo gi¸ trÞ ®­êng kÝnh nång ®é trung gian sÏ ®­îc ®­êng kÝnh cña chÕ phÈm thö. Trªn trôc hoµnh øng víi gi¸ trÞ ®­êng kÝnh võa t×m ®­îc cña mÉu thö, kÎ ®­êng vu«ng gãc víi trôc hoµnh c¾t ®­êng ®­êng chuÈn võa vÏ ®­îc t¹i mét ®iÓm vµ tõ ®iÓm nµy trªn ®­êng chuÈn h¹ vu«ng gãc víi trôc tung sÏ t×m ®­îc gi¸ trÞ nång ®é  øng víi ®­êng kÝnh cña mÉu thö.

Ho¹t lùc cña chÕ phÈm ®­îc tÝnh ra phÇn tr¨m so víi chuÈn theo c«ng thøc sau:

 

R%  =	Ho¹t lùc t×m thÊy cña chÕ phÈm ´ 100
	Ho¹t lùc t×m thÊy ë nång ®é trung gian